欧宝体育app登录:基于UPLC特征图谱和Q-Marker量值传递评价经典名方半夏白术天麻汤颗粒剂的关键生产工艺

　　原标题：基于UPLC特征图谱和Q-Marker量值传递评价经典名方半夏白术天麻汤颗粒剂的关键生产工艺

　　摘要：目的基于特征图谱相关性和质量标志物（quality markers，Q-Marker）转移率评价半夏白术天麻汤（Banxia Baizhu Tianma Decoction，BBTD）颗粒剂的生产环节，明确关键控制点。方法采用Acclaim TM RSLC LotValidation-120 C 18色谱柱（100 mm×2.1mm，2.2 μm）进行分离，流动相为乙腈-水溶液，梯度洗脱，体积流量0.3 mL/min，检测波长235 nm，柱温30℃。以BBTD基准样品为参比，建立3批中试样品的UPLC指纹图谱，并进行相似度评价，分析Q-Marker在各生产环节的损失，评价生产工艺的合理性。结果与BBTD基准样品相比，提取液、浓缩液、干膏粉、颗粒剂中均存在对应特征峰，以10种指标性成分及其总量表征的3批BBTD中试样品关键质量属性与其基准样品基本保持一致。结论基于特征图谱和Q-Marker在各环节之间的量值传递，为经典名方BBTD制备工艺评价和质量控制提供了的理论依据。

　　半夏白术天麻汤（BanxiaBaizhu Tianma Decoction，BBTD）于1732年清·程国彭撰《医学心悟》中首次出现，现收录于国家中医药管理局2018年发布的《古代经典名方目录（第一批）》，由半夏、天麻、白术、橘红、茯苓、甘草6味中药组成，化学成分包括生物碱、有机酸类、黄酮类、甾醇类、氨基酸、芳香族成分、半夏淀粉、半夏蛋白以及多种微量元素等成分[1]，主治风痰上扰所致眩晕头痛、胸闷呕恶、舌苔白腻、脉弦滑等证，是息风化痰的代表方剂。临床常用于治疗高血压病、美尼尔氏综合征、椎-基底动脉供血不足性眩晕、偏头痛、脑梗死等痰湿壅盛证[2]。

　　2020年9月28日，国家药品监督管理局发布《中药注册分类和申报资料要求》（2020年第68号），明确中药3.1类“应提供按照国家发布的古代经典名方关键信息及古籍记载进行研究的工艺资料”，需要在国家发布的古代经典名方目录和关键信息基础上开展研发工作。2021年4月26日，国家药品监督管理局发布《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（征求意见稿）》（以下简称《指导原则》）。由于古代医籍记载的传统煎煮工艺多以水分蒸发量控制煎煮时间，而现代中药制药过程包括提取、浓缩、干燥、制粒等多个工艺步骤[3]，经典名方复方制剂是否与传统汤剂的质量保持一致性是评价工艺合理性的关键所在[4]。

　　刘昌孝院士[5]提出中药质量标志物（qualitymarker，Q-Marker）新概念，以及从质量传递与溯源、成分特有性、有效性、可测性、复方配伍环境出发的复方中药Q-Marker研究和发现“五原则”，为评价经典名方复方制剂制备工艺合理性和建立全程质量控制及质量溯源体系提供了高效可靠的解决方案[6]。本项目组在Q-Marker初步辨识研究的基础上[7]，研究发现多酚类物质组是BBTD主要药效成分[8]，其中天麻素、柚皮苷、橙皮苷、橙皮素、异甘草素、甘草素、川陈皮素、橘红素、新橙皮苷、芸香柚皮苷分别是天麻、橘红、甘草中的指标成分，峰面积归一化法计算各峰面积之和占总峰面积的70%以上。本研究采用UPLC，建立BBTD颗粒剂的特征图谱，以UPLC特征图谱相关性及天麻素、柚皮苷、橙皮苷、橙皮素、异甘草素、甘草素、川陈皮素、橘红素、新橙皮苷、芸香柚皮苷转移率对BBTD颗粒剂生产过程中各个环节进行评价，既保证成品颗粒剂与传统汤剂的一致性，又能快速、准确地评估各生产环节对成品颗粒剂质量的影响，明确关键环节，对生产过程实施更为精准有效的控制，使BBTD颗粒剂的质量更加稳定可控。

　　UtiMate300超高效液相色谱仪，美国Thermo Fisher公司；AE224C型分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；KQ-250DA型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；DZF-6050型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；GLZ2-25型干法制粒机，江苏国朗机械制造有限公司。

　　半夏为天南星科半夏属植物半夏Pinellia ternata (Thunb.) Breit.的干燥块茎，产地山西绛县、甘肃西和、山东济南；天麻为兰科天麻属植物天麻Gascrodia elata Bl.的干燥块茎，产地四川、贵州；橘红为芸香科柑橘属植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥外层果皮，产地广东化州、浙江、四川；白术为菊科苍术属植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，产地安徽亳州、河北、浙江；茯苓为多孔菌科茯苓属真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf的干燥菌核，产地安徽金寨、安徽安庆、湖南邵阳；甘草为豆科甘草属多年生草本植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎，产地分别为内蒙古鄂尔多斯、内蒙古赤峰、内蒙古包头。以上药材经山东省中医药研究院靳光乾研究员鉴定，符合《中国药典》2020年版标准。半夏（清）饮片、天麻饮片、白术（麸炒）饮片、橘红饮片、茯苓饮片、甘草（炒）饮片均为实验室自制，批号及产地信息见表1。

　　2.1.1基准样品制备工艺通过对古今文献的分析，对BBTD的经方来源、处方剂量及制法进行考证[9]，确定全方的煎煮方法为半夏饮片9 g、天麻饮片6 g、茯苓饮片6 g、橘红饮片6 g、白术饮片15 g、甘草饮片4 g，加500 mL水，煎煮（武火煮沸、文火慢煎）2次，每次0.5 h，合并滤液。取10 mL水煎液于25 mL西林瓶中，放入−18℃冰箱中预冷冻24 h后，置于−80℃预冷2 h的冷冻干燥机，冻干温度为−80℃，线 h。采用L 18 (3 7 )随机数表法对6味饮片（表

　　）进行随机组合及排序，重复上述操作，即得18批BBTD基准样品（S1～S18）[10]。2.1.3浓缩工艺取提取液进行减压浓缩，温度

　　～65℃，线 MPa，浓缩至密度为1.18～1.20（25℃），以浸膏不黏壁，流动性好为宜，得浓缩液。2.1.4干燥工艺取浓缩液进行线℃，线 MPa，得干膏粉。

　　2.1.5制粒工艺取干膏粉适量，加入甜菊素17 g及适量麦芽糊精调整粉末总量为158 g/kg，混合均匀后将干膏粉装入干法制粒机，固定垂直给料速度25 r/min，水平送料速度40

　　45 r/min，调整压辊转速5～7 r/min，压辊压力10～13 MPa，制得颗粒，过筛，收集10～40目颗粒[12]，即得BBTD颗粒剂。2.2BBTD基准样品特征图谱的建立及比较分析2.2.1

　　40 kHz）30 min，静置，放冷，再称定质量，用甲醇补足损失的质量，摇匀，经0.22 μm滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。2.2.3混合对照品溶液的制备精密称取对照品天麻素2.64 mg、柚皮苷2.20 mg、橙皮苷1.67 mg、橙皮素1.65 mg

　　2.34 mg、甘草素1.92 mg、川陈皮素1.31 mg、橘红素1.37 mg、新橙皮苷1.49 mg、芸香柚皮苷1.43 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。2.2.4精密度考察精密吸取同一供试品溶液（S1），依照上述色谱条件连续进样6次，按《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，以保留时间和峰面积均适中的柚皮苷为参照峰，BBTD颗粒剂特征峰相对保留时间RSD

　　0.80%，相对峰面积RSD均小于2.90%，表明本方法精密度良好。2.2.5重复性考察取同一批样品（S1）6份，按照“2.2.2”项方法制备供试品溶液，并按照“2.2.1

　　BBTD颗粒剂特征峰相对保留时间RSD均小于0.88%，相对峰面积RSD均小于2.80%，表明方法重复性良好。2.2.6稳定性考察取同一供试品溶液（S1），分别于制备后0、4、8

　　12、16、24 h进行检测，记录指纹图谱，以柚皮苷为参照峰，各特征峰相对保留时间RSD均小于0.98%，相对峰面积RSD均小于2.60%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。2.2.7特征图谱的建立及相似度计算将18批不同批次BBTD的基准样品图谱数据导入国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012

　　S1，对照图谱生成方法为平均数，时间窗宽度设为0.10 s，多点校正，自动匹配，生成对照指纹图谱，计算相似度。得到18批BBTD基准样品的指纹图谱，见图1。S1～S18批BBTD

　　精密吸取“2.2.3”项下的混合对照品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图2。经对照品比较鉴定出共有峰中10个特征峰，每个特征峰的保留时间分别为1.887 min（天麻素）、15.003 min（芸香柚皮苷）、15.890 min（柚皮苷）、16.570 min（橙皮苷）、17.410 min（新橙皮苷）、20.007 min（甘草素）、24.500 min（橙皮素）、25.287 min（异甘草素）、26.653 min（川陈皮素）、27.590 min（橘红素）。对各特征峰进行归属研究，结果见图3。其中天麻素（1号峰）归属于天麻饮片，芸香柚皮苷（2号峰）、柚皮苷（3号峰）、橙皮苷（4

　　7号峰）、川陈皮素（9号峰）、橘红素（10号峰）峰归属于橘红饮片，其余甘草素（6号峰）、异甘草素（8号峰）峰归属于甘草（炒）饮片。2.2.9BBTD颗粒剂各生产环节样品特征图谱相关性分析通过对BBTD的提取液、浓缩液、干膏粉、颗粒剂和基准样品之间的一致性进行评价，得到BBTD颗粒剂各环节样品的特征图谱，结果见图3

　　0.865）、浓缩液（0.845）、干膏粉（0.833）、颗粒剂（0.809）、基准样品（1.000）。从各环节特征图谱的相似度结果来看，虽然工业化生产过程中制备工艺包括提取、浓缩、干燥、制粒，与传统汤剂不同，但在严格控制生产工艺的前提下，提取液、浓缩液、干膏粉和颗粒剂的质量与基准样品可以保持一致性。2.3基于Q-Marker的BBTD颗粒剂

　　10个特征峰所对应的成分天麻素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草素、橙皮素、异甘草素、川陈皮素、橘红素为BBTD颗粒剂Q-Marker。2.3.2线性关系考察精密称取“2.2.3”项下的混合对照品溶液，加甲醇稀释不同质量浓度的指标性成分对照品溶液，采用“2.2.1”项下色谱条件进样，以质量浓度为横坐标（

　　0.697 mg/g，转移率为23.52%～48.61%；异甘草素质量分数为0.045～0.328 mg/g，转移率为8.38%～18.99%；川陈皮素质量分数为0.210～0.421 mg/g，转移率为42.32%～45.16%；橘红素质量分数为0.154～0.574 mg/g，转移率为37.65%～40.26%。选取大生产饮片进行中试生产制得3批BBTD颗粒剂，计算3批颗粒剂的含量及转移率，结果见表3、4。从表中可以看出，橙皮苷从饮片（质量分数9.326 mg/g）转移到提取液（质量分数8.975 mg/g）的转移率最高，达到96.24%，橘红素从饮片（质量分数0.154 mg/g）转移到提取液（质量分数0.127 mg/g）的转移率最低，仅为66.88%。但经过浓缩、干燥最后到制得的颗粒剂后普遍损失较大，3批颗粒剂中橙皮苷质量分数分别为5.821、5.424、6.086 mg/g，由饮片到颗粒的平均转移率为61.95%，转移率最高。异甘草素质量分数分别为0.046、0.049、0.051 mg/g，由饮片到颗粒的平均转移率为32.03%，转移率最低。3讨论3.1基于传递与溯源的

　　《指导原则》指出，应按照国家发布的古代经典名方关键信息及古籍记载，研究、制备基准样品。应固定炮制、前处理、煎煮、滤过、浓缩、干燥等制备方法和工艺参数，制备不少于15批基准样品。应开展基准样品的质量研究，采用专属性鉴别和多成分、整体质量评价指标表征其质量。基于上述要求，本研究综合考察了18批BBTD基准样品的饮片-基准样品相关性，以Q-Marker均值的±30%为波动范围，建立全程可追溯的质量控制体系[16]。18批基准样品中天麻素、芸香柚皮苷、橙皮苷和甘草素含量在其均值±30%范围内，柚皮苷、橙皮素、异甘草素、川陈皮素、橘红素和新橙皮苷在饮片中含量较低，再叠加实验误差，导致个别批次在此范围外。18批基准样品中10种成分总量的平均值为5.16 mg/g，均在±30%范围内（2.32～6.16 mg/g）。提示10种指标成分及其总量可以作为评价工艺和质量一致性的考核标准。

　　《指导原则》要求，应对中试规模以上生产的中间体、制剂及所用的药材饮片进行相关性研究，并与基准样品的质量标准进行对比，说明生产全过程的量质传递情况。因此，需要对颗粒生产环节的整体性进行评价[17]

　　本研究通过天麻素、柚皮苷、橙皮苷、橙皮素、异甘草素、甘草素、川陈皮素、橘红素、新橙皮苷、芸香柚皮苷的含量确定各环节量值传递关系，利用UPLC特征图谱整体性对饮片、提取液、浓缩液、干膏粉、颗粒剂与基准样品间的一致性进行评价，确定经典名方BBTD

　　BBTD颗粒剂能否与传统汤剂保持质量一致性的关键。在BBTD颗粒剂制备过程中，浓缩、干燥由于较长时间的热处理过程，加热时间过长或加热温度过高，会造成药效成分量或各成分的组成发生变化，引起BBTD颗粒剂配伍环境发生变化，可能会影响药效。目前冷冻干燥被认为是干燥的最佳选择方法，能最大程度保留物品的属性，但是冷冻干燥的成本是传统干燥方法的5倍左右，在要求降低群众药费负担、保障廉价药生产供应的背景下，并不是最理想的选择。而在选择其他干燥方式时，就要特别注意要针对BBTD提取液中已知多酚类药效物质的理化性质，严格控制工艺参数[18]，才能有效保证经方制剂的有效性。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突参考文献（略）返回搜狐，查看更多责任编辑：

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