欧宝体育app登录:整合指纹图谱与多成分含量测定的酸枣仁汤质量评价研究

　　）始载于东汉末年张仲景所著《伤寒杂病论》：“酸枣二升、甘草一两、知母二两、茯苓二两、川芎二两”，“虚劳虚烦不得眠，酸枣汤主之”。方中重用酸枣仁，以其性味甘平，入心肝经，养血补肝，宁心安神，为君药；茯苓宁心安神，知母滋阴清热，为臣药，以助君药安神除烦之效；佐以川芎调畅气机，疏达肝气，与君药相配，酸收辛散并用，相反相成，具有养血调肝之妙；甘草生用，和中缓急，为使药。诸药相伍，共奏养血安神，清热除烦之功。酸枣仁汤临床经典用途为肝血不足、虚烦不眠证。随着后世医家的灵活加减演变，该方临床多应用于治疗睡眠障碍、焦虑症和抑郁症等疾病

　　药理研究表明酸枣仁汤能够抑制正常小鼠的自主活动，并显著延长阈上剂量戊巴比妥钠诱导的睡眠时间，具有镇静催眠的作用[7]；能够增加生理状态下大鼠进入高架十字迷宫中开臂的次数，起到抗焦虑的作用[8]；具有显著回调抑郁模型大鼠的新奇摄食时间等的抗抑郁作用[9]；对睡眠剥夺大鼠的学习记忆能力有改善作用[10]。

　　中药药效作用的发挥有赖于其所含的化学成分，且化学成分含量的高低和稳定性直接影响了其药效作用的强弱。酸枣仁汤市售产品剂型种类繁多，如锭剂、颗粒剂、浓缩散剂和合剂等。课题组前期采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱定性分析了酸枣仁汤颗粒的化学成分[11]，主要为黄酮类、三萜类、苯酞类、甾体皂苷类、生物碱类和有机酚酸类等，可见其化学组成十分复杂。何博赛课题组采用HPLC-DAD-ELSD和HPLC-DAD方法分别对实验室自制酸枣仁汤口服液中13个成分及自制酸枣仁汤颗粒中11个成分进行了测定[12-13]。鉴于中药组成的多样性及其发挥药效多靶点和多途径性的特点，指纹图谱与多成分含量测定相结合的整体质控模式，可以实现从宏观全息成分到微观指标成分对中药方剂的全面质量分析[14-15]，可为评价不同市售剂型酸枣仁汤的质量提供一种更为全面的方法。

　　本研究整合指纹图谱与多成分含量测定对酸枣仁汤进行质量评价。首先，建立10批不同来源中药材组成的自制酸枣仁汤的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱，并采用2012版中药色谱指纹图谱相似度软件进行相似度评价；其次，建立同时测定酸枣仁、川芎、知母和甘草13种指标成分含量的方法，并应用于10批自制酸枣仁汤和10批市售不同剂型的质量评价。研究结果将为酸枣仁汤药动学和药效学实验提供稳定可控的物质基础，为经典名方酸枣仁汤的整体质量控制与评价提供参考。

　　Waters e 2695型高效液相色谱仪，包括四元泵、柱温箱、自动进样器、DAD检测器和Empower工作站，美国Waters公司；蒸发光散射检测器ELSD 6000，美国奥泰Alltech公司；WSK-A型空气发生器，天津市津分分析仪器制造有限公司；CP214型万分之一电子天平，奥豪斯有限公司；KQ5200E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Heal Force 13R型高速冷冻离心机，上海力申科学仪器有限公司；LGJ-10C型冷冻干燥机，四环福瑞科仪科技发展有限公司；MD-JY30Q3-401型煎药壶，美的生活电器制造有限公司。

　　试药：色谱级甲醇、乙腈，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；屈臣氏饮用水，广州屈臣氏食品饮料有限公司，其他试剂均为分析纯。

　　对照品乌药碱（批号HR21517W4）、斯皮诺素（批号72063-39-9）、6′′′-阿魏酰斯皮诺素（批号HF173829198）、酸枣仁皂苷A（批号20160315）、酸枣仁皂苷B（批号PS010872）、新芒果苷（批号HR15511Z2）、芒果苷（批号HR1469S2）、异芒果苷（批号HR10037W4）、知母皂苷BII（批号HR16522S1）、阿魏酸（批号HR15328S1）、甘草苷（批号HR4919S1）、异甘草苷（批号H15423S1）和甘草酸（批号5744）均购自宝鸡市辰光生物科技有限公司，质量分数均＞98%。

　　参照第5版《方剂学》教材，将酸枣仁、知母、茯苓、川芎、甘草按18∶10∶10∶5∶3的比例称取药材，精密称定，加10倍量饮用水，浸泡30 min，武火煎煮至沸，换文火煎煮保持微沸30 min，8层纱布趁热滤过。药渣加8倍量水，文火微沸20 min，8层纱布滤过，合并2次滤液，减压浓缩至1 g/mL（生药量计），在压力10 Pa，−60℃下冷冻干燥成冻干粉。

　　2.2.1对照品溶液的制备取对照品适量，精密称定，加70%甲醇分别制成含新芒果苷2 mg/mL、乌药碱1 mg/mL、芒果苷1 mg/mL、异芒果苷1 mg/mL、甘草苷1 mg/mL、斯皮诺素1 mg/mL、阿魏酸1 mg/mL、6′′′-阿魏酰斯皮诺素1 mg/mL、异甘草苷1 mg/mL、知母皂苷BII2 mg/mL、酸枣仁皂苷A 1 mg/mL、酸枣仁皂苷B 1 mg/mL、甘草酸2 mg/mL的单一对照品储备液；分别吸取以上13种对照品储备液适量，加70%甲醇制成不同质量浓度的混合对照品溶液。

　　2.2.2供试品溶液的制备取酸枣仁汤冻干粉约0.3 g（按生药量计1.5 g），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇40 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得酸枣仁汤供试品溶液。

　　酸枣仁汤散剂、颗粒剂、锭剂约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇40 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得酸枣仁汤散剂、颗粒剂、锭剂供试品溶液。

　　精密量取酸枣仁汤合剂3 mL，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇40 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得酸枣仁汤合剂供试品溶液。

　　2.2.3阴性样品溶液的制备取“2.1”项下的阴性样品，按“2.2.2”项下方法分别制备缺酸枣仁阴性、缺知母阴性、缺川芎阴性、缺甘草阴性样品溶液。

　　2.4.1精密度考察取同一批次的酸枣仁汤冻干粉（S5），按“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，连续进样6次，记录各共有峰的保留时间和峰面积。结果表明，HPLC-DAD 282、335 nm及HPLC-ELSD指纹谱图中，样品各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

　　2.4.2稳定性考察取同一批次的酸枣仁汤冻干粉（S5），按“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，分别于室温放置0、3、6、9、18、30 h后，按“2.3”项下色谱条件进样分析，记录各共有峰的保留时间和峰面积。结果显示，同一样品室温放置30 h内HPLC-DAD 282、335 nm及HPLC-ELSD指纹谱图中，样品各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3.0%，表明供试品溶液在室温条件下30 h内稳定性良好。

　　2.4.3重复性考察取同一批次的酸枣仁汤冻干粉（S5），分别按“2.2.2”项下方法制备成6份供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样分析，记录各共有峰的保留时间和峰面积。结果显示，HPLC-DAD 282、335 nm及HPLC-ELSD指纹谱图中，样品各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值均小于3.0%，表明该提取方法的重复性良好。

　　2.4.4指纹图谱的建立及相似度分析取“2.1”项下方法提取的10批酸枣仁汤，按“2.2.2”项下的方法进行制备，按“2.3”项下测定方法分析供试品溶液，并记录生成的HPLC-DAD-ELSD色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012年版）”对上述图谱进行处理分析。以色谱图S1为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度为0.1，对10批酸枣仁汤的指纹图谱进行拟合生成对照图谱（R），根据峰面积的稳定性和分离度共标定了13个共有峰。在HPLC-DAD 282 nm指纹图谱中标定5个共有峰，其中以芒果苷峰作为参比峰（S峰），见图4；HPLC-DAD 335 nm指纹图谱中标定4个共有峰，选择斯皮诺素峰作为参比峰（S峰），见图5；HPLC-ELSD指纹图谱中标定4个共有峰，以酸枣仁皂苷A峰作为参比峰（S峰），见图6。10批酸枣仁汤的指纹图谱与对照指纹图谱自动匹配，282 nm下相似度为0.907～0.999，335 nm下相似度为0.926～0.999，ELSD下相似度为0.946～0.999。

　　2.5.1专属性考察分别取“2.2.2”项下制备的酸枣仁汤供试品溶液、系列质量浓度的混合对照品溶液及缺各药味阴性溶液，按“2.3”项下方法进样测定，结果如图7～9所示，各指标成分与其相邻成分之间的分离度＞1.5，各药味阴性样品溶液色谱图在待测成分出峰位置无干扰，表明该方法下13种待测成分专属性良好。

　　2.5.2线性关系考察将“2.2.1”项下制成的6个质量浓度的混合对照品溶液，按照“2.3”项下色谱条件依次进样测定，并记录13种成分的峰面积。其中知母皂苷BII、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B及甘草酸以质量浓度的对数为横坐标（X），指标成分峰面积的对数为纵坐标（Y）进行线性回归，分别绘制标准曲线并得到相关系数和线性范围；其它成分以质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，分别绘制标准曲线并得到相关系数和线性范围。按信噪比为3计算13种指标成分的检测限，按信噪比为10计算13种指标成分的定量限，结果见表4。13种指标成分在各自质量浓度范围内线性关系均良好。

　　2.5.3精密度考察精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，记录6次进样中13种指标成分的峰面积，计算峰面积RSD值，为日内精密度；第2、3天吸取同一混合对照品溶液10 μL，按相同条件进样分析，每天连续进样3次，计算13种指标成分的峰面积RSD值，为日间精密度。结果（表5）表明，13种成分日内、日间精密度RSD值均小于3%，仪器精密度良好。

　　2.5.4稳定性考察取酸枣仁汤冻干粉（S6）约0.2 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于室温下放置0、3、6、9、18、30 h后，按“2.3”项下色谱条件进样分析，提取其在282、335 nm下的色谱图，记录13种成分在测定波长下的峰面积，并用外标法计算各成分含量，计算RSD值，结果见表5。结果表明，13种成分含量的RSD值小于3%，供试品溶液在30 h内稳定性良好。

　　2.5.5重复性考察取同一批次酸枣仁汤冻干粉（S6）6份，每份约0.2 g。按照“2.2.2”项下方法制成6份供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别进样分析，提取其在282、335 nm下的色谱图，记录13种指标成分在测定波长下的峰面积，并用外标法计算各成分含量，计算RSD值，得6份供试品各成分含量重复性结果，结果见表5。结果表明，6份供试品溶液中13种成分含量的RSD值小于3%，提取方法的精密度良好。

　　2.5.6加样回收率考察取同一批次已测定13种指标成分含量的酸枣仁汤冻干粉（S6）6份，每份0.1 g，精密称定，分别加入具塞锥形瓶中，精密加入1 mL混合对照品溶液（与样品中13种指标成分相同含量的混合对照品溶液），按“2.2.2”项下的方法制成供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件分别进样测试，计算6份供试品平均加样回收率及RSD值，结果见表5。6份供试品中13种指标成分的平均回收率分别在其限度范围内，RSD值均小于3%，表明提取方法的准确度良好。

　　2.5.7样品测定取10批自制酸枣仁汤冻干粉及10批不同剂型的市售酸枣仁汤制剂按照“2.2.2”项下方法分别进行制备，取供试品溶液各10 µL注入液相色谱仪，按“2.3”项下色谱条件于282 nm下测定新芒果苷、乌药碱、芒果苷、异芒果苷和甘草苷，335 nm下测定斯皮诺素、阿魏酸、6′′′-阿魏酰斯皮诺素和异甘草苷，在ELSD下测定知母皂苷BII、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和甘草酸，样品含量测定结果见表6。不同厂家酸枣仁汤散剂和细粒剂中酸枣仁指标成分斯皮诺素0.155～0.871 mg/g，酸枣仁皂苷A 0.361～0.979 mg/g；知母中知母皂苷BII3.658～20.924 mg/g，芒果苷0.270～6.041 mg/g；甘草中甘草苷1.538～12.023 mg/g，甘草酸4.896～36.365 mg/g；川芎中阿魏酸0.160～1.269 mg/g。而实验室自制10批酸枣仁汤中13种成分含量波动范围较小，制备工艺稳定。

　　2.5.8多元统计分析10批不同厂家及自制酸枣仁汤以13种指标成分含量制成数据矩阵导入联川生物云平台进行层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）。由图10可知，酸枣仁汤中13个指标成分含量在4种不同剂型和8个不同品牌的市售产品中差异悬殊。STT生产的浓缩锭剂与浓缩颗粒剂中的指标成分含量接近且聚为一类；SH生产的2种剂型也可聚为一类。

　　本研究所涉及的13种指标成分，包括黄酮类、皂苷类和生物碱类，化学结构及极性差异较大。为了满足不同类型成分的提取效率，分别考察了70%甲醇和甲醇对酸枣仁汤冻干粉的提取效果，结果显示70%甲醇对所有成分的提取效率更高。在此基础上，考察了不同提取溶剂体积（10、20、40 mL）对待测成分提取效果的影响，结果显示70%甲醇40 mL进行提取时13种成分提取完全，含量测定结果稳定。

　　为了使13种指标成分达到基线分离，且不受其它成分的干扰，本研究对色谱条件进行了优化。在同一梯度洗脱条件下，首先考察了Waters XBridge C 18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、Agilent Zorbax SB C 18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、Apllo C 18（250mm×4.6 mm，5.0 μm）和Phenomenex Luna C 18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）4种品牌色谱柱的分离能力，结果显示Phenomenex-C 18色谱柱对13种指标成分分离度良好，且峰型对称；其次，分别考察了0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.2%甲酸水溶液-乙腈和0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈3种不同的流动相体系下色谱峰的分离情况，结果显示在0.1%甲酸水溶液-乙腈系统下色谱峰整体分离度较好；最后，考察了不同柱温（25、30℃）对指标成分分离能力的影响，结果显示，柱温为30℃时对13种待测成分的分离能力最强。

　　为了使指标成分尽可能在最大吸收波长下进行测定，本实验采用DAD检测器对13种待测成分单一对照品进行全波长扫描，结果显示乌药碱、新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、甘草苷在282 nm下吸收较强；斯皮诺素、6′′′-阿魏酰斯皮诺素、阿魏酸和异甘草苷在335 nm下吸收较强；而知母皂苷BII、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和甘草酸为三萜皂苷，在紫外下无吸收，因此选择ELSD通用型检测器对以上4种成分进行测定。

　　中药复方具有多成分、多靶点、多途径的作用特点，因此在进行质量评价时应进行组方分析。中药复方的组方药味是在中医药理论指导下进行的，因此本研究选择与君、臣、佐、使密切相关的主要化学成分作为质控指标。本实验选择了归属于酸枣仁（君）、知母（臣）、川芎（佐）和甘草（使）4味药的13种指标成分进行测定。

　　酸枣仁中斯皮诺素和6′′′-阿魏酰斯皮诺素是含量较高且具有镇静催眠活性的化学成分[16-17]；在体外药效实验中，酸枣仁皂苷A能够显著抑制青霉素引起的大鼠海马神经元细胞兴奋[18]，而酸枣仁皂苷B可以增加神经元细胞表面的γ-氨基丁酸A型（γ- aminobutyric acid type A，GABA A）受体的表达[19]，并通过促进氯离子通道开放起到镇静催眠的作用[20]；乌药碱可能是酸枣仁治疗抑郁症的重要成分之一[21-22]。

　　另有研究表明，知母中黄酮类化合物芒果苷等能够通过抑制核转录因子-κB（nuclear factor- κB，NF-κB）的活化改善脂多糖诱导的神经细胞炎症，这可能是其改善神经退行性疾病的机制[23]；知母皂苷BII则具有抗阿尔茨海默病、抗抑郁、抗糖尿病等多种药理活性[24]。茯苓中三萜类成分茯苓酸能够增加GABA受体的α、β亚基，减少γ亚基从而与其他镇静催眠药物起到协同作用，延长啮齿类动物的睡眠[25]。

　　本实验曾试图对茯苓中的茯苓酸A、猪苓酸C进行测定，但在此条件下未检测到上述成分，与岳佑淞等[26]的研究结果一致。佐药川芎中阿魏酸的钠盐能够显著改善老年痴呆患者的认知能力和记忆力，且具有抗血栓、抗氧化等药理活性[27-28]。甘草苷能够上调下丘脑5-羟色胺、去甲肾上腺素水平，并改善模型大鼠的更年期抑郁症[29]；甘草酸对注射镰孢菌酸致NE耗竭大鼠模型具有剂量依赖性的神经保护作用[30]，且作为神经炎症介质高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）的抑制剂，对癫痫模型斑马鱼的记忆障碍有显著的改善作用[31]。

　　由于中药材来源广、产地多等复杂情况，中药产品的质量常悬殊较大，特别是有效成分含量差异明显。近年来酸枣仁价格攀升，采收过程中抢青严重成为影响酸枣仁质量的主要因素。斯皮诺素是酸枣仁药材及饮片的质量控制指标之一。

　　本研究中10批市售酸枣仁汤斯皮诺素含量波动范围较大（0.155～0.871 mg/g），可能与酸枣仁的采收、产地等原因有关。因此从源头控制中药材的来源和品质对制剂质量优劣至关重要。对于同一生产厂家STT的浓缩颗粒和浓缩锭剂，13个指标成分含量稳定，表明该生产厂家的原料固定且生产工艺稳定。

　　此外，本研究收集的不同产地酸枣仁汤制剂原药材组成比例差异较大。如日本和中国台湾受仲景经方[32]影响，酸枣仁汤中君药酸枣仁占比较大，市售剂型中酸枣仁、茯苓、知母、川芎、甘草药材配比分别为10∶5∶3∶3∶1和15∶5∶3∶3∶1；而中国香港和中国大陆的酸枣仁汤制剂药材比例为5∶4∶2∶2∶1和5∶3∶2∶2∶1。

　　本研究建立了酸枣仁汤指纹图谱结合多成分定量的质量评价方法，应用于自制和市售酸枣仁汤制剂的质量评价。结果表明，该方法准确、可靠，为酸枣仁汤的质量评价提供科学依据。

　　来 源：李佳涵，王 慧，刘佳星，杜晨晖，闫 艳．整合指纹图谱与多成分含量测定的酸枣仁汤质量评价研究 [J]. 中草药, 2022, 53(15): 4698-4708 .返回搜狐，查看更多